Стефано дебютировал в качестве певца в 1946 году, исполнив партию Де Грие в опере "Манон" Массне в Реджо-нель-Эмилия. С 1947 года выступал на сцене театра Ла Скала. В 1948-65 годах пел в Метрополитен Опера.
Самой знаменитой и любимой партнершей Ди Стефано на сцене и в записях была великая певица Мария Каллас. С ней он предпринял в 1973 году большое международное концертное турне.
Музыкальная критика единодушно называла Ди Стефано одним из самых ярких и талантливых итальянских оперных певцов второй половины XX века мирового уровня. В его обширном репертуаре были партии Ленского, Альфреда, Хозе, Канио, Калафа, Вертера, Рудольфа, Радамеса, Ричарда и другие.
Певец долго болел: он так и не оправился от ран, нанесенных ему грабителями в Кении в 2004 году.